ČESKÁ UROLOGIE / CZECH UROLOGY – 1 / 2021

20 PŘEHLEDOVÝ ČLÁNEK Ces Urol 2021; 25(1): 17–26 EQUC zůstává, že organismy vyžadující ke svému růstu jiné podmínky nebo speciální živiny se ani touto robustní metodou vykultivovat nepodaří. Druhý způsob zkoumání MM využívá jednu z přelomových technologií molekulární biologie: sekvenování nukleových kyselin. Protože většina z nás nesekvenuje nukleové kyseliny každý den, připomeneme si základní princip: DNA polyme‑ ráza syntetizuje nový řetězec komplementární DNA dle existujícího templátu a pořadí inkorpo‑ rovaných deoxyribonukleotid‑fosfátů dešifruje konkrétní DNA sekvenci (10). Namísto jednoho si nyní představte miliony různých fragmentů DNA sekvenované paralelně v jednom okamžiku na čipu velikosti dvou sim‑karet v plně automa‑ tizovaném systému, který zkrátí dobu zpraco‑ vání vzorku od odběru po kompletní přečtení genetické informace na řádově hodiny. V rámci jednoho pracovního cyklu (tzv. runu) přístroje Illumina MiSeq, který je v současnosti nejužíva‑ nější platformou NGS (11), lze takto zpracovat DNA z desítek vzorků různého původu a bio‑ logické povahy (12). Detekce bakterií technikou sekvenování je založena na existenci DNA, která se vyskytuje pouze u prokaryot a nemůže tedy být obsažena v žádné lidské buňce. Jde o vysoce konzervovaný gen pro 16S rRNA (r jako ribozo‑ mální), který však v sobě obsahuje hypervariabil‑ ní regiony V1 až V9. Unikátnost hypervariabilních regionů se využívá při NGS k taxonomickému zařazení mikroorganismů (13). Nevýhodou NGS je, že metoda není kvantita‑ tivní (proto vždy hovoříme o „relativní abundan‑ ci“, tj. procentuálním zastoupení sekvencí nále‑ žejících určitému druhu, vztaženému k celkové kvantitě DNA ve vzorku – obr. 1) a krom toho ne‑ lze s jistotou říci, že detekované fragmenty DNA pocházejí z aktuálně živého mikroorganismu (14). NGS je dále zatížena řadou metodologických pastí a nejasností (11), jejichž rozbor leží mimo zaměření tohoto článku. Zpracování těžko představitelného objemu generovaných dat je vyhrazeno softwarovým algoritmům (15), s jejichž pomocí se vzniklé sek‑ vence filtrují dle délky, odstraňují artefakty a pro‑ kazatelně reálné úseky DNA se nakonec porovná‑ vají (opět automaticky a online) s mezinárodními databázemi DNA všech dosud známých mikroor‑ ganismů. To umožňuje taxonomické zařazení do tzv. operačních taxonomických jednotek (OTU). Dle kontextu může OTU představovat druh, rod, čeleď – podle toho, jak podrobně byla DNA ze vzorků sekvenována a jak jsou získané fragmenty specifické (pro konkrétní druh, rod či jen řád atp.). I tak zůstává enormní množství informací, k je‑ jichž zpracování byla vyvinuta řada biostatistických metod využívaných původně v mikrobiologii a eko‑ logii, které jsou založeny na modelování a konstruk‑ ci hypotéz spíše než na tradičním statistickém po‑ suzováním pravděpodobnosti neplatnosti nulové hypotézy. K popisu mikrobiomu potom používáme názvosloví opět převzaté z buněčné biologie a eko‑ 0% 20% 40% 60% 80% 100% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Proteobacteria Firmicutes Bacteroidetes Actinobacteria Jiné Obr. 1. Graf relativní abundance kmenů zastoupených v 19 vzorcích moči (vlastní data autorů) Fig. 1. Relativa abundance graph of phyla represented in 19 urine samples (original data) 100 % 80 60 40 20 % 0