73 / 100
319
Ces Urol 2016; 20(4): 317–325
ORIGINÁLNÍ PRÁCE
dochází k extrémní kondenzaci chromatinu a ztrátě
nukleosomální struktury typické pro somatické
buňky za vzniku vysoce stabilního a transkripčně
inertního komplexu. Při těchto dramatických pře‑
stavbách je až 85% histonů nahrazeno přechodný‑
mi proteiny a následně protaminy, které křížovými
vazbami prostřednictvím disulfidických můstků
stlačují chromatin do výsledného tvaru amerického
koblížku („doughnut“ shape). Zbylých 15 % histonů
vázaných na DNA je lokalizováno v oblastech gene‑
ticky významných pro vývoj časného zárodku (např.
promotorové oblasti, lokusy kontrolované imprin‑
tingem nebo lokusy kódující mikro-RNA). Kompakt‑
ní struktura a nerozpustný charakter chromatinu
spermií chrání otcovskou genetickou informaci
při přenosu mužským a ženským reprodukčním
traktem (7). Změny v jakékoliv fázi reorganizace
chromatinu mohou negativně ovlivňovat funkci
spermií (8). Přesné mechanizmy vedoucí k abnor‑
malitám chromatinu ve spermiích dosud nebyly
zcela objasněny, ale uvažuje se, že důležitou roli
může hrát (1) defektní kondenzace chromatinu
v průběhu spermatogeneze, (2) selhání apopto‑
tické kontroly, které umožňuje přežití defektních
spermií, (3) oxidační stres, (4) fragmentace vyvolaná
aktivitou endogenních kaspáz a endonukleáz a (5)
další patologické vnitřní a environmentální faktory
zahrnující nádorová onemocnění, cytostatika, va‑
rikokélu, dlouhodobé horečky, leukocytospermii,
profesionální expozici toxickým látkám, pokročilý
věk, apod. U infertilních mužů s predispozicí k frag‑
mentaci DNA ve spermiích se mohou uplatňovat
i genetické faktory jako polymorfizmus v genech
kontrolujících integritu genomu, meiotickou re‑
kombinaci, gametogenezi, opravné dráhy DNA,
detoxikační dráhy a antioxidační ochranu (5, 6, 9).
Ve světle těchto poznatků a s rozvojem techno‑
logií asistované reprodukce je zjevné, že dosavadní
diagnostika mužské infertility založená na konvenč‑
ní analýze spermií je nedostatečná. Průkaz zvýšené
fragmentace DNA ve spermiích může být význam‑
ný nejen pro posouzení fertilizačního potenciálu
spermií
in vivo
, ale i při hodnocení kvality spermií
před jejich využitím pro intrauterinní oplození (IUI),
fertilizaci in vitro (IVF) nebo intracytoplazmatickou
aplikaci spermie (ICSI). V posledních letech je proto
věnována značná pozornost metodám umožňují‑
cím posouzení různých aspektů poškození spermií,
včetně poškození DNA. K dispozici jsou jak metody
detekující přímo zlomy v DNA, tak metody nepří‑
mé, umožňující stanovení fragmentace DNA na
základě průkazu poruch v kondenzaci chromatinu
(10). Do první skupiny patří zejména kometový
test (Comet assay) neboli jednobuněčná gelová
elektroforéza a TUNEL [terminal deoxynucleotidyl
transferase-mediated 2`-deoxyuridine 5`-triphos‑
phate (dUTP)-nick end-labeling]. Nejčastěji využíva‑
nou nepřímou metodou je tzv. „sperm chromatin
integrity assay“ (SCSA) a v poslední době i „sperm
chromatin dispersion test“ (SCD).
Kometový test
umožňuje kvantifikovat zlomy
v DNA na úrovni jednotlivých buněk. Po rozmíchání
v agaróze jsou buňky naneseny na podložní sklo
a ovlivněny detergentem s vysokou koncentrací
solí k extrakci buněčných proteinů a membrán.
Následuje denaturace DNA v alkalickém prostředí
a elektroforéza, při které dochází v místech zlomů
k migraci rozvolněných smyček a fragmentů DNA
z jádra ke kladné elektrodě, zatímco intaktní DNA
zůstává v jádře (nukleoidu). Množství vycestované
DNA tak odráží stupeň jejího poškození (podrobně
viz. 11). Na rozdíl od somatických buněk jsou sper‑
mie chráněny membránou bohatou na disulfidic‑
ké vazby a DNA je v nich mnohem kompaktněji
kondenzována, což brání buněčné lyzi. Lyzační
proces je proto při zpracování spermií kombinován
s expozicí silnému antioxidantu, jako je dithiothrei‑
tol (DTT) (12) nebo dlouhodobým enzymatickým
působením např. proteinázou K (13).
TUNEL
Metoda kvantifikuje inkorporaci značeného deoxy‑
uridin trifosfátu (dUTP) do jedno- a dvouřetězco‑
vých zlomů DNA v reakci katalyzované terminální
deoxynukletidyl-transferázou. Množství inkorpo‑
rovaného dUTP pak může být kvantifikováno jak
průtokovým cytometrem, tak fluorescenčním nebo
světelnýmmikroskopem (14). Zejména hodnocení
FACSem poskytuje klinicky významné výsledky, po‑
dobně jako u kometového testu však zatím u této
metody nebyla stanovena obecně uznávaná hra‑
nice vymezující snížený fertilizační potenciál.